解万翠中国传统发酵食品微生物多样性及其代谢研究进展

中国传统发酵食品微生物多样性及代谢研究进展

谢万翠1、尹超1、宋琳1、徐志颖1、于文禄1、贾俊涛2、赵宏伟1、张俊毅3、李玉锦4*、杨锡红1*

1(青岛科技大学海洋科学与生物工程学院 山东青岛 266042) 2(青岛海关出入境检验检疫局 山东青岛 266002) 3(青岛鑫和源生物科技有限公司) ., 山东青岛 266002) 4(泰祥集团山东省冷冻食品加工技术企业重点实验室, 山东荣成 264303)

摘要 传统发酵食品中微生物种群结构复杂多样。 研究发酵过程中微生物相组成和代谢特征，可以揭示微生物菌群结构组成与代谢产物之间的关系，进而更好地控制发酵食品的品质。 本文总结了以豆制品、乳制品、粮制品和水产品为原料的典型中国传统发酵食品中微生物结构的演变，并结合分析了发酵食品中微生物的结构组成和种群进化规律。随着现代检测技术的发展和代谢产物的变化规律，及其对寻找传统发酵食品核心功能微生物的重要作用，以及我国传统发酵食品产业化的前景。

关键词 发酵食品； 微生物； 作品; 代谢

发酵是古老的食品加工和保鲜方法之一[1]。 在有益微生物及其酶的作用下，食品原料中的糖、脂类、蛋白质等主要营养成分被分解，转化为不具有特殊风味和营养成分。 传统发酵食品在中国有着悠久的历史，是中国饮食文化的重要体现。 悠久的发展历史造就了原料种类繁多、产品种类繁多[2]，如酒、发酵调味品等，其原料及产品的主要风味特征如表1所示。

表1 常见传统发酵食品原料及主要风味特征

表1传统发酵食品产品来源

在传统的发酵食品生产过程中，各种微生物在原料中自发富集，从而逐渐形成相对稳定的菌群和生态环境。 在这种发酵环境中，原料生产出人们期望的食品，并产生能够促进人类健康的新化合物，同时去除对健康潜在不利的物质[3]，因此微生物被认为是决定食品质量的关键因素。发酵食品，而传统发酵食品的发酵系统是一个相对开放的环境，导致其含有丰富的微生物资源。 在长期的发酵驯化过程中，筛选并保留了丰富、优良的菌相资源。 为了揭示食品发酵过程中微生物的发酵机理，目前许多研究集中在发酵食品的微生物多样性和结构演替方面，以期为未来发酵食品的产业化和标准化提供理论基础。 本文重点对不同传统发酵食品的菌相结构、演替和代谢进行综述，并对未来发酵食品的研究方向进行展望。

1 传统发酵食品中微生物的多样性与进化

传统发酵食品的品质特性会因环境和人为因素的不同而有所差异。 复杂的菌相组成使得无法有效分析发酵食品中微生物的多样性及其在发酵过程中的结构演替。 据分析，传统的培养方法无法满足人们对发酵食品中微生物多样性的研究。 随着分子生物学和生物信息学的快速发展，微生物组学等非培养方法可以有效揭示微生物如何影响食品发酵过程。

20世纪90年代以来，非培养研究方法逐渐应用于食品发酵微生物的研究领域。 例如，浓度梯度凝胶电泳（聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳，PCR-DGGE）方法得到广泛应用，利用PCR-发酵食品中菌相研究的DGGE论文数量自20世纪90年代以来呈指数级增长。 通过分析这些论文的研究成果，PCR-DGGE可以有效分析发酵食品中微生物的多样性和菌相结构。 继承法[4]。 近年来，随着测序技术的发展和成本的降低，高通量测序越来越多地用于检测发酵食品中的微生物基因组，以揭示其组成和演替规律。 实验方法的进步推进了传统发酵食品中复杂微生物菌群结构变化的研究。

1. 1 传统发酵豆制品

传统发酵豆制品是亚洲的特色食品，历史悠久，品种繁多。 豆豉、豆瓣酱、豆腐、酱油等是中国传统发酵豆制品的典型代表。 传统发酵豆制品的生产过程通常被认为是在开放的环境中进行，导致细菌组成复杂多变。 发酵原料在发酵过程中发生一系列复杂的生化反应，不仅赋予其独特的风味，而且提高了豆制品的功能性和保健功能。 一般认为，在豆制品发酵过程中，微生物及其分泌的胞外酶对风味物质的产生、营养成分的变化以及食品质地的形成有着至关重要的影响。

发酵涉及的菌相非常复杂，包括有利于发酵的菌相，也包括导致腐败甚至对人体有害的菌相。 因此，分析发酵过程中细菌相结构的变化，可以揭示微生物种类和遗传的多样性，对传统发酵豆制品的发酵控制和品质改善具有重要的指导意义。 李[5]等。 利用高通量测序分析了中国传统豆类发酵食品豆瓣酱中的微生物菌落结构。 结果表明，除乳酸菌和不动杆菌在发酵过程中发生剧烈变化外，其他菌种相对稳定； 豆沙中的优势微生物仅包括四联球菌属、乳酸菌属、葡萄球菌属、不动杆菌属以及假单胞菌属（假单胞菌属）和链球菌属。 耿玉环[6]等。 采用PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳）指纹技术，系统分析了高盐稀醪发酵工艺生产的广东酱油发酵过程中微生物组成的变化趋势。 结果发现，在酱油酿造过程中，微生物结构组成呈现出由复杂到简单的演替规律。 酱油的高盐生产发酵环境对大多数细菌有很强的抑制作用。 同样，对豆豉和腐乳中菌相组成的研究结果分析表明，豆豉中参与发酵的芽孢杆菌主要优势微生物为枯草芽孢杆菌[7]，而腐乳中的主要优势微生物为枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌[8]。

1. 2 传统发酵乳制品

来自内蒙古、西藏、新疆等地区的传统发酵乳是我国传统发酵乳制品的典型代表。 传统发酵乳制品表现出明显的地域特征。 微生物的种群结构和数量与当地气候、环境、奶源等因素有关[9]。 对奶酪等传统发酵乳制品的微生物菌群结构进行研究，不仅可以揭示其发酵原理，更好地控制发酵过程和质量，还可能有助于建立其产地追溯体系。

支楠楠[10]等。 利用 Illumina Miseq 深度测序研究分析了来自 7 个地区的 9 种酸奶样品中的微生物组成。 结果表明，酸奶中的细菌主要为厚壁菌门，并在属水平上对细菌组成进行了分析。 发现链球菌为主要优势微生物，占87.1%，其次为乳杆菌，仅占10.3%； 杨杰等人。 等[11]对新疆采集的22份酸奶样品中的乳酸菌组成进行了研究，结果表明，德氏乳杆菌亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.)。 为主要优势菌，占82%。 对传统发酵酸奶中主要优势菌群的检测结果表明，不同地区、不同奶源也会对酸奶中微生物菌群结构产生显着影响。 例如，张敏[12]利用高通量测序技术对新疆克孜勒苏柯尔克孜自治州和塔城地区7种不同奶源的乳制品和发酵乳制品的细菌相结构进行了分析。 结果表明，地区和奶源的差异对发酵乳制品菌相组成有显着影响。 影响。 对获得欧盟原产地保护的意大利拉古萨诺地区奶酪的微生物菌群结构研究表明，乳杆菌、乳球菌、肠球菌和明串珠菌为主要优势菌群，同时检出低水平的假单胞菌。 和酵母菌，而大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌和沙门氏菌从未检测到，这表明奶酪发酵条件有效抑制了有害细菌的生长和繁殖[13]。 发酵乳制品中的微生物复杂多样。 不同乳品菌株的同质性较低，代谢产物也不同。 在工业生产中根据代谢机制控制发酵过程显得尤为重要。

1. 3 传统发酵粮产品

1.3.1 醋

山西老陈醋、镇江香醋是中国传统谷物发酵食品的典型代表，早已工业化。 它们的生产是一个相对开放的环境，涉及众多微生物，导致微生物结构复杂。 组成，应用现代分子生物学方法可以有效分析不同发酵阶段的菌相组成及其演替规律。

山西老陈醋的生产发酵过程主要分为制曲、糖化、酒精发酵和醋酸发酵四个步骤。 由于酿造过程的不同，菌相结构在不同阶段会发生巨大变化。 聂[14]等。 对连续几天采集的样品进行微生物鉴定统计，结果显示不同阶段微生物的细菌群落结构存在显着差异。 从整个发酵过程来看，从大曲到酒精发酵期间，细菌和真菌的多样性呈现下降趋势，而醋酸发酵初期，由于醋酸的添加，菌群数量有所增加。酸发酵，但随着发酵的进行，乳酸菌和醋酸菌占了优势，抑制了其他微生物的生长，从而减少了细菌种类的数量； 为了分析镇江香醋发酵阶段主要功能微生物的演替规律，陶景兰等人研究了镇江香醋的发酵阶段主要功能微生物的演替规律。 [15]建立了一种有效的实时荧光定量PCR方法。 对主要优势微生物的定量分析发现，醋酸醅中的优势微生物为醋酸菌、乳酸菌和酵母菌。 三者占细菌和真菌总数的80%以上。 在醋酸发酵阶段，醋酸菌和乳酸菌的数量首先增加。 然后减少，然后维持一定水平直至发酵结束。

1.3.2 酒精饮料

传统发酵酒主要有黄酒、黄酒、白酒等酒。 我国发酵酒历史悠久，发酵技术独特，酒体浓郁。 “曲为酒之骨”，充分说明了微生物在白酒酿造、生产过程中所发挥的重要作用。 酒中特殊风味的产生和营养成分的变化受到曲中菌相组成的影响。 因此，许多学者和专家对酿酒功能菌的筛选、鉴定和应用做了大量的研究。

王丽等人。 [16]利用高通量测序技术对酱香型白酒发酵窖不同阶段的窖底泥和环境土壤样品的细菌结构组成进行了分析。 结果发现，与窖底泥的细菌组成相比，酒庄周边土壤中的细菌组成更加丰富和多样，说明随着土壤逐渐被驯化为酒庄底泥，细菌的多样性呈现出多样性。种类逐渐减少，细菌种类逐渐形成乳杆菌科、梭菌属。 优势菌群以梭菌科、瘤胃球菌科等厌氧微生物为主。 雷振和等. [17]分析了酿造香型白酒所用的大曲和酒醅的细菌组成。 发酵粮中的优势菌主要有肠杆菌科、醋杆菌科等，占原核微生物的70%以上，真核微生物占优势。 微生物主要有梁足科、念珠菌、毕赤酵母等。

1. 4 传统发酵水产品

发酵水产品主要是指在新鲜的鱼、虾、蟹、贝类等水产品中添加高含量的食盐，然后用微生物长时间发酵而制成的食品。 主要包括虾油、虾酱、鱼酱油、鱼露等。不同地区的传统虾酱由于地域、制备工艺和原料的不同，其微生物组成也有所不同。 例如，传统印尼虾酱中参与发酵的主要乳酸菌为片球菌（Pediococcushalophilus 和 Pediococcusdextrinicus）[18]，而戴凌英[19]利用高通量测序技术分析了虾酱中的细菌群落结构和多样性。 ，发现发光杆菌为主要优势菌属，占71.94%； 其次是弧菌，占12.54%。 此外，还分离鉴定出嗜盐细菌[20]、产蛋白酶霉菌和酵母[21]等有利于改善快速发酵虾酱风味的微生物，用于虾酱快速发酵技术的改进和虾酱的快速发酵。推动其产业化。 同样，在鱼露生产过程中，研究人员也研究了鱼露发酵过程中细菌相结构的变化，从而选择耐盐细菌作为发酵剂或添加蛋白酶，以缩短鱼露的发酵周期，提高品质鱼露。 出于产品质量的目的[22]，黄子艳[23]对传统发酵工艺生产的鱼露中微生物在不同发酵阶段的菌相组成进行了分析，证实乳酸菌和酵母菌是主要的优势微生物。 结合各项理化指标对乳酸菌和游离氨基酸的变化规律进行分析发现，乳酸菌和酵母菌的变化趋势与各项指标的变化规律存在明显的相关性。 发酵技术在水产品加工中的应用可以有效地利用低价值的水产品生产高价值的食品，极大地促进水产品的利用和有效保存[25]。 对传统发酵中微生物多样性和群落结构动态变化的研究，可以有效设计发酵剂，优化发酵条件，实现其工业化生产。

2 传统发酵食品微生物的代谢特征

传统发酵食品风味独特、营养丰富，发酵食品中的一些生物活性物质对人体健康具有积极作用。 其独特的风味和营养成分主要是原料在微生物和酶的作用下转化而形成的，其发酵过程和物质转化概况如图1所示，其中微生物的代谢在生物活性物质中起着关键作用发酵食品在发酵过程中的特性、风味等，因此对传统发酵食品中的微生物代谢研究可以更好地揭示微生物在发酵过程中的主要作用，分析微生物与代谢物之间的关系可以更好地掌握微生物发酵机理为产品质量控制及产业化提供理论依据[3]。

图1 发酵食品的发酵过程及物质转化概况[2]

图1 发酵过程概述

发酵食品的转化

通过分析发酵食品菌相组成与代谢产物之间的相关性，可以发现发酵系统中的功能微生物群[26]。 该方法是寻找复杂发酵系统中核心微生物群的主要方法之一。 例如，WU[27]等人。 等采用高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（HS-SPME）研究镇江香醋中微生物群落代谢机制。 /GC-MS）检测样品中的成分，通过宏基因组测序揭示微生物分类和功能组成，构建香醋中底物分解和主要风味形成的微生物群代谢网络，分析不同代谢途径的微生物为了揭示白酒发酵过程中的核心微生物群，王鹏[28]计算了白酒发酵过程中丰度排名前20的细菌属和真菌属以及61种代谢物之间的Spearman相关系数，发现在白酒醅发酵过程中，较重要的代谢贡献者是乳酸菌、酵母菌和念珠菌； 该检测方法是在对奶酪中微生物菌群结构和数量研究的基础上，采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）等技术检测奶酪中的风味物质，并通过统计数据建立微生物与代谢物之间的联系。分析（见表2），为奶酪发酵工艺的改进提供理论支持。 该方法还对蟹酱[29]、鱼露[30]、醋[31]等传统发酵食品中的微生物代谢特征或核心功能微生物进行了研究。 对微生物代谢特性的研究和核心微生物的寻找，可以为研究人员以工程化理念设计高效的多菌种系统提供理论依据[32-33]，从而构建可控的多菌种发酵系统，实现传统的多菌种发酵系统。高效、有目的地生产发酵食品。

表2 奶酪中微生物与代谢物的关系[13]

表2 奶酪中微生物与代谢物的关系

3.传统发酵食品微生物组与代谢研究方法

近年来，宏基因组学和宏转录组测序已广泛应用于发酵食品微生物组成和代谢的研究，蛋白质组检测技术也出现在发酵食品代谢的相关研究论文中。 代谢组学分析为深入分析发酵食品中微生物组成和物质产生的分子机制提供了重要的方法学和技术支撑[34]。

3.1 宏基因组

基于高通量测序技术的宏基因组测序技术已广泛应用于包括发酵食品在内的各种环境中微生物群落结构的研究。 与普通rRNA测序不同，宏基因组测序提取环境中所有微生物的总DNA，然后构建相关基因组文库，利用基因组学研究方法分析环境样本中所有微生物的DNA组成和群落特征。 研究可以更好地揭示环境中微生物的丰度，有效检测丰度较低的微生物，并促进新物种的发现[35]。

李[36]等通过16S rRNA基因高通量测序比较了我国4个不同省份的面团发酵剂样品和不同发酵阶段面团中的细菌群落。 实验结果可以揭示不同省份样品的差异，分析过程中细菌群落的演替后，宏基因组检测还可以解析可能有助于风味物质产生的功能基因簇和通路[37]。

3.2 宏转录组

同样基于高通量测序技术的宏转录组测序，针对的是活跃表达基因的转录组。 反转录后，获得cDNA序列并测序。 与宏基因组测序技术相比，宏转录组测序可以直接检测微生物在特定时间和区域活跃表达的基因，更有效地分析微生物代谢与风味物质的关系。 JUNG[38]提取泡菜29天发酵过程中5个时间点的总mRNA样本，并使用Illumina GA IIx对表达的mRNA序列进行测序。 结果表明Lac基因的表达过程。 肠膜菌在发酵初期最为活跃。 Lb 的基因。 Sakei和W. koreensis在发酵后期表达活跃，许多与碳水化合物运输和乳酸水解相关的基因被发现大量表达。 实验结果有助于了解泡菜发酵情况下乳酸菌代谢相关基因的表达情况以及不同发酵阶段乳酸菌的活性。

3.3 宏蛋白质组

2004年，RODR GUEZ-VALERA提出了元蛋白质组的概念，即环境中所有生物体蛋白质组的总和[39]。 宏蛋白质组的研究方法与传统的蛋白质组研究方法类似，其流程一般包括蛋白质样品制备、蛋白质分离和蛋白质鉴定等。通过适当的蛋白质提取方法、分离程序以及先进的串联质谱技术，宏蛋白质组学揭示了主要的蛋白质组学研究方法。微生物群体中的功能蛋白。 宏蛋白质组学早已应用于各种环境下微生物生态系统功能的研究，但大多数发酵食品都含有较高的蛋白质含量，这对宏蛋白质组学应用于发酵食品微生物研究是一个很大的挑战。 吉[40]等。 利用宏蛋白质组学方法鉴定并注释了中国传统发酵鱼中的 2 175 个蛋白质。 这些蛋白质属于19个门的553个菌株，其中包括10个乳酸菌菌株。 基于KEGG注释系统，发现链球菌、芽孢杆菌、埃希氏菌和假单胞菌中涉及代谢途径的蛋白有1 217个，其中氨基酸代谢相关蛋白352个，氨基酸降解相关蛋白63个，表明表明这些菌株可能是产生芳香化合物的菌株，宏蛋白质组学信息加深了对发酵鱼中微生物代谢模式的认识，可为提高发酵鱼的稳定性和适口性提供理论依据。 使用 2D-DIGE 和质谱法研究醋发酵过程中的宏蛋白质组。 结果表明，大部分蛋白质在功能上与应激反应、TCA循环和不同代谢途径相关； 它已应用于白酒等发酵食品中微生物组成和代谢的研究[41]。

4 结论与展望

我国传统发酵食品种类繁多，但大多仍采用传统生产工艺，生产规模小、工艺粗糙、发酵过程不可控、发酵周期长、易受外界环境影响，使得产品质量很差。 它不稳定，带来一定的食品安全问题等，严重制约了传统发酵食品的发展。 对微生物结构组成及演替规律、发酵代谢机制及规律的详细研究和总结，可以更好地开发传统发酵食品，对推动传统发酵食品产业化具有重要意义。