活性蘑菇 Lentinus crinitus 在农工业废物上产生木质素降解酶

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文字| 周训淼

编辑| 周训淼

前言

卡廷加干旱生态区是巴西特有的，是迄今为止很少被研究的担子菌栖息地。 由于其半干旱气候，该地区的真菌可能含有木质素降解酶，这些酶在农工业废物生物转化的工业过程中具有生物技术潜力。 采用响应面统计编程来优化香菇菌株分泌的酶，如漆酶（Lac）、木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）。

三个变量：不同浓度的大麦和木薯废物、pH 值和温度。 结果表明，MnP酶的酶活率最高（23.5 IU/L）。 另外，当底物成分为50%大麦和50%木薯、pH值为7、温度28℃、培养期28天时，MnP酶的泌酶效果最佳。 然而，进一步的研究对于测试这些酶在木质素生物转化中的效率并建立它们在大规模应用中的使用模式至关重要。

卡廷加地区伞形孢菌研究概况

卡廷加是巴西特有的生态区，主要对应半干旱地区，气候炎热干燥。 半干旱地区年平均气温约25.5°C，雨季短（3至5个月），旱季长（7至9个月），降雨分布不规则。

对巴西巴伊亚半干旱地区 Serra da Jibóia 的木质素降解无柄担子菌的研究发现，卡廷加和大西洋森林 (Mata Atlântica) 可能具有相似的生物多样性。 这些地区的大多数物种在该州已被记录为54种。与其他地区和生态区相比，半干旱和卡廷加地区对担子菌类真菌多样性的研究较少。

伞形孢菌包括所有具有明确的子实层的担子菌门。 大多数担子菌物种会导致木材腐烂（通过木质素或纤维素或两者和半纤维素的水解）。 这些物种被称为木质素降解或木质纤维素降解真菌，并根据腐烂形态分为白腐病、棕色腐病或软腐病。

在白腐真菌中发现了细胞外酚氧化酶活性，表明存在木质素降解酶。 随后表明，这些反应是由两种氧化还原酶——漆酶和过氧化物酶催化的。 氧化酚类化合物的能力已被用作鉴定真白腐真菌的标准。 分离出漆酶（Lac）后，还发现了其他过氧化物酶，称为木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP），它们在木质素降解中发挥作用。

MnP 和 LiP 是糖蛋白，似乎是白腐真菌中最常见的木质素降解酶。 前者大约有十五种不同的分离同工酶，与后者密切相关，因为它氧化Mn2+和Mn3+，这些阳离子可以氧化木质素的酚单元，也可能参与苯酚的分解过程。 第三种酶，漆酶（Lac），由于其在木质素降解和有毒酚类污染物解毒中的作用，在过去十年中引起了相当大的关注。

这些废物的积累会危害环境、破坏资源，并在回收和生物质保护方面造成重大问题。 已经开发了几个利用这些材料的项目，将农业工业废物转化为具有高附加值的化合物和产品。 由于木质纤维素废物在环境中的可用性，它也是能源生产的绝佳替代品。 在生物过程中使用农业废物作为底物不仅具有经济效益，而且可以最大限度地减少与废物积累相关的环境问题。

响应面方法 (RSM) 是一套用于构建经验模型的数学和统计技术。 通过仔细设计实验，目标是优化受多个自变量影响的响应变量。 实验是一系列称为试验的测试，其中改变输入变量以确定输出响应变化的原因。

该方法的主要特点是考虑了响应变量的异质性以及响应变量的相关性。 数学模型越来越多地用于解释生化反应的反应。 在许多情况下，实验计划允许通过较少数量的试验来评估影响发酵过程的参数之间的相互作用。 对于裂解酶，响应面方法经常用于优化和验证培养基成分对酶生产的影响，以及优化和验证影响酶生产的参数。

利用从巴西巴伊亚半干旱地区采集的担子菌真菌，通过固体发酵研究其对农工业废物的木质素降解酶（漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶）。 分泌，以及所获得的酶活性的部分生化特征。

在含有琼脂和 Remazol 亮蓝 R (RBBR) 染料的培养皿中测试了 30 种未表征的真菌菌株的脱色能力。 L. crinitus菌株在短时间内表现出较大的脱色环，因此被选择用于鉴定和进一步研究。

该真菌菌株是在巴西巴伊亚州米格尔卡尔蒙 Sete Passagens 州立公园的 Cachoeira Jajai 步道上采集的，坐标为南纬 13°39’46” 和西经 39°19’39”。 使用未与空气接触的部分子实体和孢子在补充有酵母提取物的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上进行分离，并连续转移以保存其谱系。 该真菌已保藏于巴伊亚微生物培养保藏中心 (CCMB UEFS)，识别号为 CCMB 553。

香菇在伞形孢菌中的地位

按照该方法，从生长约20天的菌丝中提取该物种的DNA。 使用 ITS 1 和 ITS4 引物，它们对应于真菌 DNA 条形码研究提出的区域。 PCR反应进行28个循环（94℃ – 4分钟、94℃ – 1分钟、50℃ – 1分钟、72℃ – 3分钟和72℃ – 7分钟）。 通过碱性磷酸酶和核酸外切酶消化（使用 ExoSap IT 试剂盒，GE）纯化 PCR 产物。

使用 Big Dye Terminator 3.1 版（Applied Biosystems）进行测序反应。 样品在自动测序仪 SCE 2410 (Spectrumedix LLC) 中进行双向测序，测序工作在费拉德桑塔纳州立大学 (UEFS) 分子实验室进行。 使用Staden Package的GAP4程序编辑获得的电泳图案。

查询 BLASTn，使用 Clustral X 程序进行比对并手动调整。 该序列已提交给 GenBank (NCBI)，编号为 KR014256。 获得分子信息后，将现场数据与MycoBank中的物种描述进行检查和验证。

使用Statistica（6.0）软件进行多变量实验设计，该程序生成实验表和响应面。 分析了以下自变量：木质纤维素底物类型、培养温度和培养基的初始pH。 作为响应（因变量）的漆酶（Lac）、锰过氧化物酶（MnP）和木质素过氧化物酶（LiP）的活性描述如下。

每个实验产生的酶提取物是通过将蒸馏水添加到瓶中、混合并在合成滤纸上过滤而获得的。 将滤液在 4℃ 下以 13,000 rpm 离心 10 分钟，取上清液用于分析。 为了制备对照组，将获得的每种提取物在100℃下加热10分钟以完全灭活酶活性。

通过将丁香醛连氮作为酶底物在 525 nm 下反应 10 分钟来测定漆酶活性。 锰过氧化物酶活性通过在过氧化氢存在下在 610 nm 处氧化酚红来测定。 木质素过氧化物酶活性通过苯乙醇在 310 nm 处的氧化来测定。

式中ΔA为吸光度变化； 106为修正系数； ？ 是消光系数； R为酶提取物的体积； T是反应时间。 在确定促进酶分泌的最佳培养条件后，还评估了推荐条件下培养时间的影响。 使用容量为 250 mL 的锥形瓶（每种废物 5 g，湿度为 90%）在 6 个不同的培养时间（真菌生长的 4、7、14、21、28 和 35 天）评估酶活性，并在20°C。

C. 木质素分解酶及其生物技术潜力

通过使用ITS 1和ITS 4引物对该谱系的ITS区域进行PCR扩增，获得了约600bp的特征片段。 分子分析显示，该谱系与香菇相似度高达94%，覆盖率达100%。 ITS 被认为是真菌的条形码，因为它是真菌中最常测序的区域，并且常用于系统学、系统发育和鉴定。 通过与现场数据的宏观特征（例如盖子的表面和形状）进行比较，也证实了在 Blast 平台上发现的识别结果。

对测试的酶进行方差分析。 LiP的F值（1.39）小于F临界值（3.68）。 在5%置信水平下，R2系数（0.64）不显着，因此数据无法通过评价。 对 Lac 的分析也不显着，在 5% 置信水平下，F 值（1.2）小于 F 临界值（3.68），系数（R2=0.60）也不显着，但在这种情况下欠拟合显着 (69.60)，这表明所获得的结果可能存在显着差异，但软件生成的曲面并不能很好地描述所生成的数据。

唯一表现出有效方差的酶是 MnP，其 F 值 (15.23) 大于 F 临界值 (6.72)，系数 (R2=0.95)。 这些结果在 1% 的显着性水平上具有统计显着性，这意味着实验确定的活性与模型预测的值之间存在良好的相关性，因为实验数据中 95% 的变异性可以通过估计来解释。模型来解释。 锰过氧化物酶的分泌取决于底物、pH 值和温度因素，但不受它们之间相互作用的影响，如帕累托图所示。

变量之间获得的二次模型的响应面分析表明，L. crinitus 锰过氧化物酶的最佳分泌条件等于底物百分比、培养温度和中性 pH。 在此条件下，酶活力值为23.59 U/L。 这一结果支持了所提出的假设，即大多数担子菌在 20°C 至 30°C 的温度范围内生长最佳，并且真菌的温度控制对锰过氧化物酶的产生具有重要影响。

据观察，比活性在 28 天持续增加，然后在第 35 天下降，直到达到最大值的一半。 对所有时间点均进行方差分析和Tukey检验进行均值比较，在5%显着性水平上差异具有统计学意义。 因此，28 d的培养时间被认为是在优化的培养条件下L. crinitus分泌MnP的最佳时间。

在不同农业废物上培养的 Pleurotus sajor-caju 中，在第 28 天发现木质素降解酶（不仅包括 MnP，还包括 Lac 和 LiP）的峰值产量。 迪尼在麦秆上种植 Phlebia rufa 和 Bjerkandera adusta 时也获得了相同的结果。

对香菇属其他真菌（例如 L. strigellus 和 L. tigrinus）中 MnP 活性的研究表明，在第 3 周左右，MnP 活性有所增加。这表明 L. crinitus 在相似的培养时间、相似的培养时间内表现出 MnP 活性的峰值。其他白腐真菌。

通过改变反应介质的pH值进行实验以确定酶活性的最佳pH值。 在优化条件下获得的 L. crinitus 的 MnP 在较宽的 pH 值范围内表现良好，从 pH 4 到 8，然后急剧下降。 验证活性的最佳pH值为5，活性为18.65 U/L。

该酶在较宽 pH 范围内的性能与其他研究不同。 白腐真菌通常在酸性较高的 pH 范围（2.6 至 4.5）内表现出 MnP 活性。 这种广泛的酶活性可能是由于酶提取物中存在多种同工酶，也表明 L. crinitus 在不同 pH 值下可以有效地表现出 MnP 活性。

综上所述

在 L. crinitus 上测试的培养条件不利于 Lac 和 LiP 的生产，应进一步进行额外的研究以确定这些酶生产的参数。 在 50% 大麦和 50% 木薯的底物组合物中，pH 7，在 28°C 下，在 28 天的培养期内使用 MnP 获得了最佳的酶分泌结果。 在这些条件下，L. crinitus 的 MnP 酶在 pH 5 和 40°C 时表现出最佳活性，并且在较宽的 pH 值和温度范围内都具有活性。

测试的谱系显示出对底物、湿度、pH、温度和孵育时间等因素下酶产量的依赖性。 使用的大麦和木薯农工业废物是生产降解木质素的酶的合适底物，为这些废物提供了新的回收选择，这些废物在该地区丰富并造成严重的环境问题。 利用途径。

参考

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